SLU-PP-332 и ДМСО: разведение, задокументированное на фото

SLU-PP-332 не растворяется в бактериостатической воде: это липофильная малая молекула, а не пептид. В описанном здесь разведении порошок сначала растворили в небольшом объёме диметилсульфоксида (ДМСО). Затем этот раствор медленно влили в бактериостатическую воду — и никогда не наоборот. Каждый шаг показан на фотографиях и в коротких видео вместе с химией растворимости, которая его объясняет.

Это не пептид, и в этом всё дело

Из-за названия соединение легко принять за пептид, но SLU-PP-332 — синтетическая малая молекула. Доклиническая литература описывает её как пан-агонист эстроген-связанных рецепторов (ERRα, ERRβ, ERRγ) и относит к инструментальным соединениям медицинской химии; данных о применении у человека не опубликовано. Обозначение отсылает к лабораторной серии, а не к аминокислотной последовательности.

Поэтому привычные по пептидам приёмы здесь и не срабатывают. Лиофилизированный пептид — аморфная таблетка из ионизируемых боковых цепей, которой вода нужна. У липофильного твёрдого вещества есть кристаллическая решётка, которую нужно разрушить, и нет ничего, вокруг чего вода могла бы выстроиться.

Правило «подобное растворяется в подобном» здесь работает в полную силу. Чтобы растворить вещество в воде, нужно разорвать её сеть водородных связей и заново выстроить её вокруг растворённой частицы. Полярные и ионные вещества оплачивают этот энергетический счёт взаимодействиями «заряд — диполь» и водородными связями, а неполярной молекуле платить нечем. Не помогает и pH: у молекулы без ионизируемых групп нет изоэлектрической точки, от которой можно было бы уйти.

Бактериостатическая вода ничего здесь не меняет. Бензиловый спирт в ней — консервант в концентрации около 0,9%, далеко не дотягивающей до сорастворителя, так что как растворитель это та же стерильная вода. Терпение и ультразвук влияют на кинетику: агломераты, пограничные слои, растворение, которое завершилось бы и так. Ни то ни другое не сдвигает равновесную растворимость, поэтому муть после ультразвуковой ванны — это суспензия, которая снова оседает.

Почему важен порядок

Диметилсульфоксид — полярный апротонный растворитель. У него большой дипольный момент, сульфинильный кислород, который необычайно хорошо принимает водородные связи, и нет кислого водорода, который он мог бы отдать. Поэтому он сольватирует и полярные, и неполярные участки одной и той же молекулы — отсюда его роль стандартного носителя для плохо растворимых в воде соединений.

Этанол, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль 400 выполняют ту же задачу в зарегистрированных парентеральных препаратах: они снижают диэлектрическую проницаемость, и неполярному веществу в такой среде уже не так неуютно. Циклодекстрины приходят к похожему результату другим путём — заключают неполярную часть молекулы в комплекс.

Раствор в сорастворителе возвращает проблему, как только появляется вода. Логарифм растворимости падает примерно по прямой по мере снижения доли сорастворителя — это классическая модель косольвентности. Там, где растворённое количество превышает ёмкость новой смеси, вещество выходит из раствора. Технологи называют это осаждением при смене растворителя.

Та же модель объясняет, почему исход решает направление смешивания. В месте, где концентрат впервые встречается с водой, местный состав на мгновение гораздо беднее сорастворителем, чем вся жидкость в среднем. Поэтому предел растворимости на этой границе превышается задолго до того, как он будет превышен в среднем.

Когда небольшой объём раствора в ДМСО медленно стекает в больший объём воды, которую держат в движении, каждый участок этой границы мал и разбавляется за считаные мгновения. Если же добавлять воду к раствору в ДМСО, весь раствор шаг за шагом проходит через все промежуточные составы, и по пути вещество может кристаллизоваться. Когда кристаллическая фаза уже образовалась, обратное растворение идёт медленно и часто не до конца. На этом рассуждении и построен порядок шагов 5–9 ниже.

Что было на столе

На фото видно, что автор использовал для этого разведения:

• флакон с 5 мг SLU-PP-332 в виде белого порошка,
• пустой стерильный стеклянный флакон на 3 мл,
• 2,5 мл бактериостатической воды в отдельном флаконе,
• 0,5 мл ДМСО квалификации Ph. Eur., набранные из большей бутылки,
• два инсулиновых шприца на 1 мл с несъёмной иглой,
• спиртовые салфетки.

Объёмы относятся именно к этому разведению и вытекают из размеров флаконов, которые были под рукой. Итоговая концентрация — это просто масса во флаконе, делённая на общий конечный объём вместе с сорастворителем, как показано ниже.

Задокументированное разведение, шаг за шагом

Шаг 1: снимаются колпачки

С флакона SLU-PP-332 и флакона бактериостатической воды сняли цветные пластиковые колпачки flip-off; пустой флакон пришёл без колпачка. После этого у всех трёх флаконов открылась резиновая пробка под металлической обжимкой.

Шаг 2: пробки протираются

Автор протёр резиновую пробку каждого из трёх флаконов спиртовой салфеткой. Стандарты асептической техники, например Общая глава 797 USP, считают укупорку критической поверхностью перед каждым проколом. По той же причине автор позже снова протирал пробку каждый раз, когда её касались.

Шаг 3: набираются 0,5 мл ДМСО

Первым инсулиновым шприцем на 1 мл автор набрал из бутылки 0,5 мл ДМСО. В жидкость погружалась только игла, но не пластиковая канюля и не цилиндр. ДМСО агрессивен по отношению ко многим пластмассам и поверхностям, поэтому чем меньше пластика он касается, тем меньше материала может в себя вобрать.

В итоге в шприце оказалось 0,5 мл ДМСО.

Шаг 4: ДМСО переносится во флакон с SLU-PP-332

На внутренней стенке цилиндра пластикового шприца есть тонкое смазочное покрытие, и ДМСО может частично его растворить. Поэтому автор работал быстро, но без спешки: ДМСО медленно перенесли во флакон с SLU-PP-332, слегка поворачивая флакон во время переноса.

Потом автор продолжал поворачивать флакон, чтобы ускорить растворение. В чистом ДМСО порошок растворяется легко: на этом шаге растворитель и делает основную работу.

Шаг 5: бактериостатическая вода переносится в пустой флакон

Позже раствор в ДМСО вливают в воду, а не наоборот, поэтому воде сначала понадобился собственный флакон. Вторым шприцем автор перенёс бактериостатическую воду из исходного флакона в пустой стерильный.

Если к пробке за это время прикасались, автор протирал её заново. Шприцами на 1 мл 2,5 мл удалось перенести за три раза: два полных шприца по 1 мл и один на 0,5 мл.

Шаг 6: ожидание, пока раствор станет прозрачным

Автор дождался, пока SLU-PP-332 полностью растворится в ДМСО и раствор станет прозрачным, как вода. Пока прозрачности не было, флакон покачивали круговыми движениями, но не встряхивали. Встряхивание вносит воздух и пену и не даёт ничего сверх того, что для малой молекулы в хорошем растворителе и так даёт покачивание.

В итоге получились два прозрачных флакона: 2,5 мл бактериостатической воды и 0,5 мл ДМСО с растворённым в нём SLU-PP-332.

Шаг 7: набирается раствор в ДМСО

Автор проколол пробку флакона с SLU-PP-332 вторым шприцем и набрал раствор.

Теперь в шприце было 0,5 мл раствора в ДМСО — это отметка 50 единиц на инсулиновом шприце U-100.

Шаг 8: раствор в ДМСО стекает в воду

Автор проколол пробку флакона с бактериостатической водой.

Именно об этом шаге и говорит модель косольвентности. Автор дал раствору в ДМСО медленно стечь по внутренней стенке стекла в бактериостатическую воду, а не впрыснул его в середину жидкости. Стекая по стенке, поступающий раствор растягивается в тонкую плёнку, которая перемешивается постепенно.

Во время остальной части переноса, как видно на фото, автор держал флакон на боку и поворачивал его, чтобы поступающий раствор нигде не скапливался в неподвижном кармане воды. Без этого движения SLU-PP-332 может выпасть в осадок на границе двух жидкостей, а выпавшее вещество надёжно вернуть в раствор нельзя.

Сразу после этого жидкость была прозрачной, но с разводами. Эти шлиры — зоны с другим показателем преломления, где богатая ДМСО и богатая водой жидкость ещё не перемешались. Твёрдым веществом они не являются.

Шаг 9: покачивание, пока не исчезнут разводы

Автор покачивал и поворачивал флакон, пока разводы не исчезли и смесь не стала выглядеть однородной. Прозрачная жидкость без разводов — видимый признак того, что ДМСО и вода полностью перемешались.

Шаг 10: утилизация

Оба шприца и пустые флаконы отправились в контейнер для острых отходов. Непрокалываемый контейнер — обычный путь утилизации игл: использованная игла в бытовом мусоре опасна для того, кто следующим возьмёт мешок в руки.

Разводы, муть и осадок

У пептида помутнение обычно означает, что что-то пошло не так. В смеси сорастворителя с водой вблизи предела растворимости оно может быть и фазовым явлением: рассеянием света на очень мелких частицах или кратковременным пересыщением. Поэтому три вещи, которые можно увидеть во флаконе, различаются по своей природе:

• Разводы — явление смешивания в прозрачной в остальном жидкости; при покачивании они исчезают.
• Муть — это свет, рассеянный очень мелкими частицами; она говорит о том, что вещество достигло предела растворимости в этой смеси или превысило его.
• Осадок или плавающие частицы означают, что вещество вышло из раствора; закристаллизовавшаяся фаза растворяется обратно медленно и часто не до конца.

Описанное выше разведение закончилось на первом варианте: разводы исчезли при покачивании. Муть или осадок означали бы, что смена растворителя опередила перемешивание.

Что холод делает со смесью

Температура сдвигает линию растворимости: у большинства органических твёрдых веществ растворимость падает при охлаждении смеси. Замораживание действует жёстче. Чистый ДМСО застывает около 18,5 °C, так что раствор в чистом ДМСО в холодильнике становится твёрдым.

В смеси с водой образующийся лёд концентрирует всё оставшееся в сжимающейся жидкой фазе. Поэтому циклы заморозки и оттаивания окончательно роняют такие смеси в осадок. Для разведённого препарата литература по обращению описывает хранение в холоде, в темноте и без заморозки. Смесь, помутневшая в холодильнике, вышла из раствора так же, как смесь, которую смешали в неправильном порядке.

Квалификация ДМСО, стерильность и рассуждения автора

ДМСО — не инертный разбавитель. Он легко проникает через кожу и мембраны и переносит с собой растворённые вещества, а в концентрированном виде раздражает ткани при контакте; это одна из причин, по которым в парентеральных препаратах долю сорастворителя держат низкой. Монографии на диметилсульфоксид удалось найти и в USP-NF, и в Ph. Eur.; они задают пределы по чистоте и содержанию воды. Технические квалификации под эти монографии не подпадают.

Стерильный ДМСО вне фармацевтической среды автору найти не удалось, и он использовал квалификацию Ph. Eur. Шприцевой фильтр из ПТФЭ позволил бы провести стерилизующую фильтрацию, как описано на странице о фильтрации. ПТФЭ — мембрана, предусмотренная для растворителей, а некоторые гидрофильные мембраны для водных растворов, например из полиэфирсульфона, для чистого ДМСО не предназначены. Такого фильтра у автора под рукой не было.

По личной оценке автора, в этом случае этого было достаточно: ДМСО сам обладает антисептическими свойствами, а раствор смешивается с бактериостатической водой, в которой есть консервант. Это собственное мнение автора, и здесь оно приведено именно как мнение.

Противоположная позиция опирается на сами стандарты. Квалификация Ph. Eur. подтверждает чистоту, а не стерильность. Антисептический эффект снижает численность части микробных популяций, но не является валидированным этапом стерилизации и ничего не делает со спорами или эндотоксинами. Бензиловый спирт в бактериостатической воде подавляет размножение микробов, но тоже не стерилизует.

По задокументированному фармацевтическому стандарту раствор становится стерильным благодаря стерилизующему фильтру 0,2–0,22 мкм или валидированному процессу стерилизации, а не благодаря свойствам входящих в него компонентов. Эта страница приводит обе позиции и не выбирает между ними.

Расчёт концентрации

Дальнейшая математика от вещества не зависит. Концентрация — это масса во флаконе, делённая на общий конечный объём вместе с сорастворителем. В этом разведении 5 мг распределены по 3 мл смеси, а не по одним 2,5 мл воды. Объём, в котором содержится заданное количество, равен этому количеству, делённому на концентрацию. Калькулятор разведения выполняет пересчёт как конвертер единиц, а сами единицы разобраны в материале что на самом деле означают мг, мл и МЕ.

Регуляторный статус

SLU-PP-332 не зарегистрирован как лекарственный препарат ни в США, ни в Европейском союзе, ни в Австралии, ни где-либо ещё, и клинических данных о безопасности и эффективности у человека не опубликовано. Это исследовательское соединение, а пометка «только для исследовательских целей» — коммерческое описание, а не регуляторная категория. Правовой статус зависит от страны — этому вопросу посвящена отдельная страница.

Частые вопросы

SLU-PP-332 — это пептид?

Нет. Это синтетическая малая молекула, описанная как пан-агонист эстроген-связанных рецепторов; её обозначение взято из лабораторной серии соединений, а не из аминокислотной последовательности. Ведёт она себя как плохо растворимое в воде органическое твёрдое вещество.

Можно ли растворить SLU-PP-332 в одной бактериостатической воде?

В сколько-нибудь полезной степени — нет. Соединение в основном неполярное, и вода не может предложить ему выгодных взаимодействий. Бензиловый спирт в бактериостатической воде — консервант в концентрации около 0,9%, слишком низкой, чтобы работать сорастворителем. Терпение или ультразвуковая ванна дают лишь суспензию, которая снова оседает.

Почему раствор SLU-PP-332 в ДМСО вливают в воду, а не наоборот?

Когда небольшой объём раствора в ДМСО попадает в больший объём движущейся воды, через промежуточные составы проходят лишь маленькие участки жидкости, и они разбавляются за считаные мгновения. Если же добавлять воду к раствору в ДМСО, весь раствор проходит через постепенно падающую долю сорастворителя, и везде, где растворённое количество превышает ёмкость такой смеси, вещество выпадает в осадок.

Стерилен ли ДМСО квалификации Ph. Eur., которым растворяли SLU-PP-332?

Нет. Фармакопейная квалификация вроде Ph. Eur. задаёт пределы по чистоте, родственным примесям и содержанию воды; о стерильности она ничего не говорит, если продукт не изготовлен отдельно как стерильный и не маркирован так. Задокументированный стандарт для стерилизации раствора на основе растворителя — фильтрация через мембрану 0,22 мкм, совместимую с этим растворителем, например из ПТФЭ.

Что означают разводы во флаконе с SLU-PP-332?

Разводы, их ещё называют шлирами, — это зоны с другим показателем преломления, где раствор в ДМСО и вода ещё не перемешались. Это явление смешивания, а не признак осадка, и они исчезают, как только жидкость после покачивания становится однородной. Стойкая муть или видимые частицы — другое дело: они указывают на твёрдое вещество, вышедшее из раствора.

Почему при разведении SLU-PP-332 с ДМСО работали быстро?

ДМСО хорошо растворяет многие пластмассы и может растворять смазочное покрытие на внутренней стенке пластикового цилиндра шприца. Чем короче контакт чистого ДМСО со шприцем, тем меньше материала переходит в жидкость, поэтому автор проводил каждый перенос быстро, но без спешки.

Меняет ли что-нибудь ультразвуковая ванна при растворении SLU-PP-332?

Ультразвук меняет скорость растворения, а не саму его возможность. Он разбивает агломераты и обновляет слой жидкости вокруг каждой частицы, но равновесная растворимость остаётся прежней.

Зарегистрирован ли SLU-PP-332 как лекарственный препарат?

Нет. Регистрационного удостоверения у него нет ни в одной крупной юрисдикции, опубликованных клинических данных о безопасности и эффективности у человека тоже нет. Пометка «только для исследовательских целей» не даёт никаких регуляторных гарантий подлинности, чистоты или стерильности.

Источники

1. Billon C, Sitaula S, Banerjee S, et al. Synthetic ERRα/β/γ agonist induces an ERRα-dependent acute aerobic exercise response and enhances exercise capacity. ACS Chemical Biology 2023;18(4):756–771. doi:10.1021/acschembio.2c00720. Preclinical mouse data; no human data. PubMed 36988910
2. Yalkowsky SH. Solubility and Solubilization in Aqueous Media. American Chemical Society / Oxford University Press, 1999. Log-linear cosolvency model.
3. Strickley RG. Solubilizing excipients in oral and injectable formulations. Pharmaceutical Research 2004;21(2):201–230. PubMed 15032302
4. USP-NF monograph "Dimethyl Sulfoxide"; European Pharmacopoeia monograph "Dimethyl sulfoxide" (Dimethylis sulfoxidum). Purity and water-content limits for pharmacopoeial grades.
5. USP General Chapter 797, Pharmaceutical Compounding — Sterile Preparations. Aseptic technique and closure disinfection. usp.org
6. U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing — Current Good Manufacturing Practice. September 2004. Sterilising filters with a rated pore size of 0.2 µm or smaller; 0.22 and 0.2 µm treated as interchangeable nominal ratings. fda.gov

Общая нейтральная информация о химии исследовательского соединения и описание одного задокументированного разведения: не медицинская консультация, не рекомендация по дозированию или применению и не предложение приобрести какое-либо вещество. У SLU-PP-332 нет регистрационного удостоверения, а законность владения и применения определяется правом страны твоего проживания. Вопросы о здоровье стоит обсуждать с квалифицированным врачом или фармацевтом.