Шприцевые фильтры для разведённых растворов пептидов
Под одним словом «фильтрация» уживаются две разные вещи: характеристика изделия и утверждение о безопасности, которое из этой характеристики не следует. С технической стороной всё довольно однозначно — документация на фильтры для водных белковых растворов называет мембрану стерилизующего класса 0,22 мкм, гидрофильный материал вроде PES, корпус малого диаметра и коннектор Люэр-лок, стерильную поставку и однократное применение. Это описание изделия, которое задерживает бактерии и механические частицы, и ничего сверх того; уместен ли этап фильтрации вообще — вопрос отдельный, и адресован он фармацевту или врачу.
Что означает стерилизующая фильтрация
Устроен шприцевой фильтр просто: небольшой полимерный корпус с запаянной внутри мембраной. Жидкость продавливают сквозь мембрану, и всё, что крупнее номинального размера пор, остаётся на входной стороне.
«Стерилизующий класс» — не рекламный эпитет, а определённая техническая классификация. По ASTM F838 мембрана получает её, если задерживает заданную нагрузку Brevundimonas diminuta — одной из самых мелких культивируемых бактерий, около 0,3 мкм — в пересчёте на квадратный сантиметр фильтрующей поверхности. Из этого испытания и выросла общепринятая международная практика: для стерилизации водных растворов принят номинал 0,22 мкм, на котором задерживаются бактерии, дрожжи и плесневые грибы.
На упаковках одной и той же классификации встречаются обозначения 0,2 мкм и 0,22 мкм — унаследованная от разных производителей условность маркировки, а не разница в задержании.
Номиналы пор и что задерживает каждый
| Номинал пор | Классификация | Что аттестован задерживать |
|---|---|---|
| 0,45 мкм | Осветляющий, не стерилизующий | Более крупные частицы и взвесь. B. diminuta проходит в заметных количествах — наблюдение, из-за которого стерилизующей нормой стал более тонкий номинал |
| 0,22 мкм (= 0,2 мкм) | Стерилизующий класс (ASTM F838) | Бактерии, дрожжи, плесневые грибы |
| 0,1 мкм | Класс задержания микоплазм | Микоплазмы дополнительно к бактериям |
| 0,02 мкм (20 нм) | Вирусозадерживающий нанофильтр | Вирусные частицы |
Чаще всего неверно читают именно строку 0,45 мкм: литература по фильтрации относит этот номинал к осветлению, то есть к предфильтрации. Роль стерилизующей нормы закрепилась за 0,22 мкм как раз потому, что мелкие бактерии сквозь более крупную пору проходят. Более тонкие номиналы отвечают на другие вопросы — стерилизующая мембрана непроницаема для бактерий, но не для всего подряд.
Материал мембраны и адсорбция пептида
Материал значит не меньше номинала пор, причём по причине, которая с просеиванием никак не связана: на поверхности некоторых мембран пептид адсорбируется и уходит из раствора.
| Мембрана | Связывание белка | Примечание |
|---|---|---|
| PES (полиэфирсульфон) | Очень низкое | Гидрофилен по своей природе, высокая скорость потока; материал, который чаще всего указывают для белковых и пептидных растворов |
| PVDF, гидрофилизированный | Низкое | Водой смачивается только обработанная марка; необработанный PVDF гидрофобен |
| CA / RC (ацетат целлюлозы, регенерированная целлюлоза) | Низкое | Гидрофильные, низкосвязывающие |
| Нейлон | Высокое | Прочно связывает пептиды; потери при извлечении задокументированы |
| PTFE | К воде неприменим | Гидрофобен; предназначен для растворителей и газов |
Пройдёт ли водный раствор вообще, решает не размер пор, а гидрофильность материала. Разведённый пептид растворён в воде, поэтому мембрана должна ею смачиваться. Гидрофобная водой не смачивается, пока её не подготовят спиртом, — а спирт оставляет свой след ровно там, где раствор должен становиться чище.
Отдельная путаница живёт в самих названиях материалов: нитрат целлюлозы связывает белок прочно, а ацетат целлюлозы и регенерированная целлюлоза — слабо. Само по себе слово «целлюлоза» о поведении при связывании не говорит ничего.
Диаметр корпуса, мёртвый объём и коннектор
Мёртвый объём — жидкость, которая остаётся в корпусе и мембране, когда поршень дошёл до упора, — растёт вместе с диаметром корпуса. В технических описаниях производителей меньшему корпусу отвечает и меньший объём пробы: корпус 4 мм указывают для объёмов порядка 1 мл, корпус 13 мм — примерно для 1–10 мл, причём мёртвый объём устройства на 13 мм измеряется десятками микролитров, а на 25 мм он заметно больше и в отдельных конструкциях превышает 1 мл. Для флакона, в котором всего 1–2 мл, это внушительная доля.
Ещё две характеристики относятся к конструкции, а не к предпочтениям. Люэр-лок — резьбовое соединение; Люэр-слип — насадочное, и давление поршня способно разъединить его прямо посреди хода. Стерилизующие фильтры поставляют в индивидуальной упаковке и стерилизуют в конечной упаковке, гамма-излучением или оксидом этилена: стерильный фильтрат предполагает стерильный фильтр. К той же спецификации принадлежит и однократность применения — использованная мембрана влажная, нагружена задержанным материалом и уже нестерильна.
Чего фильтрация не убирает
Именно здесь возможности мембранного фильтра регулярно преувеличивают. Мембрана 0,22 мкм — барьер по размеру для бактерий и механических частиц, и этим её функция исчерпывается.
- Эндотоксины (пирогены) проходят насквозь. Это липополисахаридные фрагменты клеточных стенок бактерий, многократно мельче поры и термостойкие; они одинаково свободно минуют и 0,22 мкм, и 0,1 мкм. Погибшие бактерии, осевшие на мембране, сами становятся источником эндотоксинов.
- Вирусы проходят насквозь. Вирусные частицы примерно на порядок мельче бактерий; для их задержания нужен нанофильтр 20 нм.
- Растворённые примеси проходят насквозь. Тяжёлые металлы, остатки растворителей и продукты распада движутся вместе с растворителем. Подлинность и чистота — вопрос к ВЭЖХ и масс-спектрометрии, а не к фильтру.
- Стерильный, апирогенный и чистый — три разных свойства. Прозрачный отфильтрованный раствор может удовлетворять первому и не удовлетворять двум остальным, и по виду не понять, какому именно.
О мембранном фильтре полезнее всего помнить, чего он не компенсирует: происхождение, подлинность, чистота и история обращения с раствором от прохождения сквозь мембрану не меняются.
Может ли фильтрация сделать хуже?
Может. Каждое дополнительное вмешательство в закрытую систему — это ещё одна возможность занести загрязнение, и публикаций, показывающих, что фильтрация вне аптечных условий в итоге снижает риск, нет; исход определяется асептической техникой вокруг этого этапа, а не мембраной. Фильтры к тому же не вполне инертны: извлекаемые и вымываемые вещества (extractables and leachables) — признанная тема фармацевтической литературы, хотя рядом с вопросом обращения с раствором она второстепенна.
Где теряется пептид
Потеря возникает не из-за просеивания: молекула пептида имеет поперечник в несколько нанометров против поры в 220 нм и проходит свободно. За потери отвечают два механизма. Адсорбция на мембране удерживает пептид на её поверхности, пока доступные центры не насытятся, — поэтому наибольшая относительная потеря приходится на первую прошедшую порцию; на низкосвязывающих мембранах вроде PES описанные в методической литературе потери невелики. Мёртвый объём — тот самый удерживаемый объём, который остаётся в устройстве.
Оба эффекта описаны в лабораторной методической литературе: среди стандартных приёмов пробоподготовки там перечислены предварительное смачивание мембраны и вытеснение мёртвого объёма. Это процедуры аналитической лаборатории с её оснащением, а не содержание этого текста. Эти два механизма объясняют форму потери, а не способ её обойти: фиксированный мёртвый объём и конечное число центров адсорбции забирают тем большую долю исходного количества, чем меньше объём и чем ниже концентрация.
Помутнение ранее прозрачного раствора
Помутнение, которое появляется через часы или дни после разведения в растворе, до того прозрачном, описывается в фармацевтической практике как признак микробного роста или выпадения пептида из раствора. Ни то, ни другое к фильтрации отношения не имеет, а стандартное обращение с препаратом, целостность которого под вопросом, — утилизация, а не осветление: продавливание мутного раствора сквозь мембрану убирает видимое свидетельство, оставляя эндотоксин и продукты распада в фильтрате. В литературе по фильтрации у осветляющего этапа заявлено другое назначение — механические частицы заведомо немикробного происхождения, например нерастворившийся порошок вскоре после смешивания. У помутнения, которое возникает только при соединении нескольких пептидов в одном шприце, объяснение другое, химическое, и разобрано оно в статье смешивание пептидов в одном шприце.
Как эту операцию описывают стандарты
Стерилизующая фильтрация — определённая фармацевтическая операция с опубликованными конвенциями: общая глава <797> Фармакопеи США, соответствующие главы Европейской фармакопеи и руководство FDA по асептическому производству. Эти тексты описывают её как выполняемую в среде с контролируемым качеством воздуха и персоналом, чья подготовка по асептике документирована, — потому они и относят стерилизующую фильтрацию к аптечной или производственной деятельности.
Регулируют эти тексты не саму работу с изделием, а условия вокруг неё, и валидированная целостность фильтра — часть этих условий: от стерилизующего фильтра в производстве ожидают проверки физическим методом, по точке пузырька или по диффузионному потоку, а это предполагает собственное оборудование, собственные критерии приёмки и собственную документацию. За пределами той среды, для которой всё это описано, такого оснащения не существует.
О технике те же стандарты фиксируют наблюдения, а не последовательность действий. Дезинфекция укупорочных элементов, контактные поверхности и качество воздуха влияют на результат не меньше, чем сама мембрана, а избыточный перепад давления на мембране — задокументированная причина её разрушения. Общее у этих текстов — сама квалификация операции: это работа, определённая для подготовленного персонала в контролируемой среде, и спецификация фильтра в ней лишь одна из частей.
Сводка характеристик
| Характеристика | Значение, приводимое в технической литературе |
|---|---|
| Номинал пор | 0,22 мкм, равнозначная маркировка 0,2 мкм; стерилизующий класс по ASTM F838 |
| Мембрана | Гидрофильный PES; гидрофильный PVDF, CA и RC перечислены как другие низкосвязывающие материалы |
| Диаметр корпуса | 13 мм указывают для объёмов пробы примерно 1–10 мл; мёртвый объём растёт вместе с диаметром |
| Коннектор | Люэр-лок — резьбовое соединение; Люэр-слип — насадочное, которое давление поршня способно разъединить |
| Форма поставки | Индивидуальная упаковка, стерилизация гамма-излучением или оксидом этилена, однократное применение |
Именно эти значения повторяются в документации на фильтры для водных белковых и пептидных растворов. Она описывает изделие и его аттестованные характеристики, а не показание к применению: уместен ли этап фильтрации вообще — вопрос к фармацевту или врачу, а не к таблице характеристик.
Частые вопросы
Какой размер пор считается стерилизующим?
Стерилизующим для водных растворов считается номинал 0,22 мкм — эту классификацию подтверждает испытание на задержание бактерий по ASTM F838. Мембрана 0,45 мкм осветляет жидкость, но по тест-микроорганизму не аттестована и проходит в литературе как предфильтр.
Чем 0,2 мкм отличается от 0,22 мкм?
Ничем. Это две исторические маркировки разных производителей для одного и того же стерилизующего класса. Задерживающая способность определяется испытанием, а не цифрой на упаковке.
Какие материалы мембран меньше всего связывают пептиды?
К низкосвязывающим относят полиэфирсульфон (PES), гидрофилизированный PVDF, ацетат целлюлозы и регенерированную целлюлозу. Нейлон связывает пептиды прочно, PTFE гидрофобен — ни тот, ни другой для водных растворов пептидов не предусмотрен.
Убирает ли стерилизующая фильтрация эндотоксины?
Нет. Эндотоксины — фрагменты клеточной стенки бактерий, они многократно мельче поры 0,22 мкм и проходят сквозь неё. Стерильность, апирогенность и химическая чистота — три разных свойства, и мембранный фильтр отвечает только за первое.
Сколько жидкости остаётся внутри шприцевого фильтра?
Удерживаемый (мёртвый) объём растёт вместе с диаметром корпуса. Корпус 13 мм обычно удерживает несколько десятков микролитров, корпус 25 мм — существенно больше; для флакона, в котором всего миллилитр-другой, это заметная доля.
Можно ли использовать шприцевой фильтр повторно?
Нет. Стерилизующие фильтры выпускаются в индивидуальной упаковке как одноразовые. Использованная мембрана влажная, нагружена задержанным материалом и уже нестерильна — это скорее поверхность для роста, чем барьер.
Источники
- ASTM F838, Standard Test Method for Determining Bacterial Retention of Membrane Filters Utilized for Liquid Filtration.
- Фармакопея США (USP), общая глава <797>, Pharmaceutical Compounding — Sterile Preparations.
- Европейская фармакопея, 5.1.1, Methods of preparation of sterile products.
- U.S. Food and Drug Administration, Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing — Current Good Manufacturing Practice (2004).
- PDA Technical Report No. 26, Sterilizing Filtration of Liquids.
- Технические описания (спецификации) производителей шприцевых фильтров стерилизующего класса — диаметр корпуса, мёртвый объём и заявленные диапазоны объёма пробы.
То, что действительно важно
Эта страница — общая информация, а не медицинская консультация и не руководство к каким-либо действиям. Стерилизующая мембрана представляет собой барьер по размеру для бактерий и механических частиц, а свойства, которые от неё чаще всего хотят получить, — апирогенность, подлинность, чистота, надёжность источника — лежат за пределами того, на что способен любой фильтр. Смежные справочные страницы: разведение, бактериостатическая и стерильная вода, основы безопасности инъекций и конвертер единиц.