Rozpuszczanie SLU-PP-332 w DMSO: udokumentowany przebieg ze zdjęciami

SLU-PP-332 nie rozpuszcza się w wodzie bakteriostatycznej, bo jest lipofilową małą cząsteczką, a nie peptydem. W udokumentowanym tu przebiegu ciało stałe najpierw rozpuszczono w niewielkiej objętości dimetylosulfotlenku (DMSO), a następnie ten roztwór w DMSO powoli dodano do wody bakteriostatycznej – nigdy odwrotnie. Każdy krok pokazują zdjęcia i krótkie filmy, wraz z chemią rozpuszczalności, która go wyjaśnia.

To nie peptyd – i właśnie o to chodzi

Nazwa często pojawia się obok peptydów, ale SLU-PP-332 to syntetyczna mała cząsteczka, którą literatura przedkliniczna opisuje jako pan-agonistę receptorów związanych z estrogenem (ERRα, ERRβ, ERRγ) i określa jako związek służący jako narzędzie badawcze w chemii medycznej; danych z badań na ludziach nie opublikowano. Oznaczenie wynika z serii laboratoryjnej, a nie z sekwencji aminokwasów. Dlatego nawyki z rekonstytucji peptydów tu zawodzą: liofilizowany peptyd to amorficzny placek liofilizatu z jonizowalnymi łańcuchami bocznymi, który łatwo oddziałuje z wodą, a lipofilowe ciało stałe ma sieć krystaliczną do rozbicia i nic, wokół czego woda mogłaby się uporządkować.

Zasada „podobne rozpuszcza podobne” naprawdę ma tu znaczenie. Rozpuszczenie czegoś w wodzie oznacza rozerwanie jej sieci wiązań wodorowych i odbudowanie jej wokół substancji rozpuszczanej; substancje polarne i jonowe płacą ten energetyczny rachunek oddziaływaniami ładunek–dipol i wiązaniami wodorowymi, a cząsteczka niepolarna nie ma czym zapłacić. Zmiana pH też tu nie pomaga, bo cząsteczka bez grup jonizowalnych nie ma punktu izoelektrycznego, od którego można by się oddalić.

Woda bakteriostatyczna niczego tu nie zmienia: zawarty w niej alkohol benzylowy to konserwant w stężeniu około 0,9%, daleko poniżej stężenia współrozpuszczalnika, więc jako rozpuszczalnik jest po prostu wodą jałową. Cierpliwość i ultradźwięki działają na kinetykę – aglomeraty, warstwy graniczne, rozpuszczanie, które i tak by się zakończyło. Żadne z nich nie przesuwa rozpuszczalności równowagowej, więc zmętnienie po użyciu łaźni ultradźwiękowej to zawiesina, z której cząstki ponownie osiadają.

Dlaczego kolejność ma znaczenie

Dimetylosulfotlenek to polarny rozpuszczalnik aprotyczny: ma duży moment dipolowy, atom tlenu w grupie sulfinylowej, który jest wyjątkowo dobrym akceptorem wiązań wodorowych, i nie ma kwasowego atomu wodoru, który mógłby być ich donorem. Dzięki temu solwatuje zarówno polarne, jak i niepolarne fragmenty tej samej cząsteczki – dlatego jest standardowym nośnikiem dla związków słabo rozpuszczalnych w wodzie. Etanol, glikol propylenowy i glikol polietylenowy 400 pełnią tę samą funkcję w dostępnych na rynku preparatach pozajelitowych: obniżają stałą dielektryczną, co ułatwia rozpuszczanie niepolarnej substancji. Cyklodekstryny osiągają podobny efekt inną drogą, zamykając niepolarną część cząsteczki w kompleksie.

Po dodaniu wody do roztworu we współrozpuszczalniku problem jednak wraca. Logarytm rozpuszczalności spada mniej więcej liniowo wraz ze spadkiem udziału współrozpuszczalnika – to klasyczny model współrozpuszczalności – a tam, gdzie rozpuszczona ilość przekracza to, co nowa mieszanina jest w stanie utrzymać, związek opuszcza roztwór. Technolodzy postaci leku nazywają to wytrącaniem przy zmianie rozpuszczalnika (solvent-shift precipitation).

Ten sam model wyjaśnia, dlaczego o wyniku decyduje kierunek mieszania. Tam, gdzie koncentrat po raz pierwszy styka się z wodą, lokalny skład jest przez chwilę znacznie uboższy we współrozpuszczalnik niż całość, więc limit rozpuszczalności zostaje przekroczony na styku cieczy dużo wcześniej, niż zostałaby przekroczona średnio. Gdy niewielka objętość roztworu w DMSO powoli wpływa do większej objętości wody utrzymywanej w ruchu, każdy fragment tej granicy jest mały i w ciągu chwili ulega rozcieńczeniu. Gdy natomiast dodaje się wodę do roztworu w DMSO, cały roztwór przechodzi krok po kroku przez każdy pośredni skład, a związek może po drodze wykrystalizować. Gdy faza krystaliczna już powstanie, ponowne rozpuszczanie jest powolne i często niepełne. Na tym rozumowaniu opiera się kolejność w krokach od 5 do 9 poniżej.

Co leżało na stole

Zdjęcie pokazuje, czego autor użył w tym przebiegu:

• fiolka z 5 mg SLU-PP-332 w postaci białego proszku,
• pusta jałowa szklana fiolka o pojemności 3 ml,
• 2,5 ml wody bakteriostatycznej we własnej fiolce,
• 0,5 ml DMSO w jakości Ph. Eur., pobrane z większej butelki,
• dwie strzykawki insulinowe 1 ml z wtopioną igłą,
• gaziki nasączone alkoholem.

Objętości opisują ten konkretny przebieg i wynikają z rozmiarów fiolek leżących na stole. Wynikowe stężenie to po prostu masa w fiolce podzielona przez całkowitą końcową objętość, łącznie ze współrozpuszczalnikiem, co omówiono niżej.

Udokumentowany przebieg krok po kroku

Krok 1: zdjęcie nasadek

Z fiolki SLU-PP-332 i z fiolki wody bakteriostatycznej zdjęto kolorowe plastikowe nasadki typu flip-off; pusta fiolka dotarła bez nasadki. Potem we wszystkich trzech fiolkach odsłonięty był gumowy korek pod metalowym kapslem.

Krok 2: przecieranie korków

Autor przetarł gumowy korek każdej z trzech fiolek gazikiem nasączonym alkoholem. Standardy techniki aseptycznej, takie jak rozdział ogólny 797 USP, traktują zamknięcie jako powierzchnię krytyczną przed każdym wkłuciem – dlatego autor przecierał korek ponownie za każdym razem, gdy później ktoś go dotknął.

Krok 3: nabranie 0,5 ml DMSO

Pierwszą strzykawką insulinową 1 ml autor nabrał z butelki 0,5 ml DMSO. W cieczy zanurzona była tylko igła, a nie plastikowa obsadka igły ani cylinder. DMSO jest agresywnym rozpuszczalnikiem dla wielu tworzyw sztucznych i powierzchni, więc im mniej plastiku dotyka, tym mniej materiału może z niego pobrać.

W efekcie w strzykawce znalazło się 0,5 ml DMSO.

Krok 4: DMSO do fiolki z SLU-PP-332

Plastikowe strzykawki mają na wewnętrznej ściance cylindra cienką warstwę poślizgową, a DMSO może ją częściowo rozpuścić. Dlatego autor pracował sprawnie, ale bez pośpiechu: DMSO powoli przeniesiono do fiolki z SLU-PP-332, lekko obracając fiolkę w trakcie.

Następnie autor dalej obracał fiolkę, aby przyspieszyć rozpuszczanie. W czystym DMSO ciało stałe rozpuszcza się łatwo; to właśnie na tym etapie rozpuszczalnik wykonuje swoją zasadniczą pracę.

Krok 5: woda bakteriostatyczna do pustej fiolki

Roztwór w DMSO dodaje się później do wody, a nie odwrotnie, więc woda potrzebowała najpierw własnej fiolki. Drugą strzykawką autor przeniósł wodę bakteriostatyczną z oryginalnej fiolki do pustej jałowej fiolki.

Jeśli w międzyczasie ktoś dotknął korka, autor przecierał go ponownie. Przy strzykawkach 1 ml przeniesienie 2,5 ml wymagało trzech podejść: dwóch pełnych strzykawek po 1 ml i jednej z 0,5 ml.

Krok 6: czekanie, aż roztwór będzie przejrzysty

Autor czekał, aż SLU-PP-332 całkowicie rozpuści się w DMSO, a roztwór stanie się przejrzysty jak woda. Dopóki nie był przejrzysty, fiolką delikatnie zataczano kręgi, a nie potrząsano. Potrząsanie wprowadza powietrze i pianę i nie daje niczego, czego w przypadku małej cząsteczki w dobrym rozpuszczalniku nie dałoby już zakręcenie fiolką.

W efekcie w obu fiolkach znajdowały się przejrzyste płyny: 2,5 ml wody bakteriostatycznej oraz 0,5 ml DMSO z rozpuszczonym w nim SLU-PP-332.

Krok 7: nabranie roztworu w DMSO

Autor przebił drugą strzykawką korek fiolki z SLU-PP-332 i nabrał roztwór.

W strzykawce znalazło się wtedy 0,5 ml roztworu w DMSO, co na strzykawce insulinowej U-100 odpowiada kresce 50 jednostek.

Krok 8: roztwór w DMSO spływa do wody

Autor przebił korek fiolki z wodą bakteriostatyczną.

To właśnie tego kroku dotyczy model współrozpuszczalności. Autor pozwolił, by roztwór w DMSO powoli spływał po wewnętrznej ściance szkła do wody bakteriostatycznej, zamiast wstrzykiwać go strumieniem w środek cieczy. Spływając po ściance, wprowadzany roztwór tworzy cienką warstwę, która miesza się stopniowo.

Przez resztę przenoszenia, jak pokazują zdjęcia, autor trzymał fiolkę na boku i ją obracał, tak by wprowadzany roztwór nigdy nie gromadził się w nieruchomym obszarze wody. Bez tego ruchu SLU-PP-332 może się wytrącić na granicy obu cieczy, a wytrąconego materiału nie da się niezawodnie z powrotem rozpuścić.

Zaraz potem płyn był przejrzysty, ale widać było w nim smugi. Te szliry to obszary o różnym współczynniku załamania światła, w których ciecz bogata w DMSO i ciecz bogata w wodę jeszcze się nie wymieszały. Nie są ciałem stałym.

Krok 9: zakręcanie fiolką, aż znikną smugi

Autor zakręcał i obracał fiolkę, aż nie zostały żadne smugi, a mieszanina wyglądała jednolicie. Przejrzysty płyn bez smug to wizualny znak, że DMSO i woda całkowicie się wymieszały.

Krok 10: utylizacja

Obie strzykawki i puste fiolki trafiły do pojemnika na ostre odpady. Pojemnik odporny na przebicie to standardowy sposób utylizacji igieł, bo zużyta igła w odpadach domowych stanowi zagrożenie dla każdego, kto jako następny weźmie worek do ręki.

Smugi, zmętnienie i osad

W przypadku peptydu zmętnienie zwykle oznacza, że coś poszło nie tak. W mieszaninie współrozpuszczalnika z wodą bliskiej granicy rozpuszczalności może to być też zjawisko fazowe: rozpraszanie światła na bardzo małych cząstkach albo przejściowy stan przesycenia. Trzy rzeczy, które można zobaczyć w fiolce, różnią się więc swoją naturą:

• Smugi to zjawisko związane z mieszaniem cieczy, która poza tym jest przejrzysta; znikają po zakręceniu fiolką.
• Zmętnienie to światło rozpraszane przez bardzo małe cząstki; sugeruje, że związek osiągnął lub przekroczył granicę rozpuszczalności w tej mieszaninie.
• Osad lub pływające ciało stałe to związek, który wypadł z roztworu; ponowne rozpuszczanie fazy krystalicznej jest powolne i często niepełne.

Opisany wyżej przebieg zakończył się na pierwszym z tych zjawisk – smugami, które zniknęły po zakręceniu. Zmętnienie lub osad oznaczałyby, że zmiana rozpuszczalnika wyprzedziła mieszanie.

Co zimno robi z mieszaniną

Temperatura zmienia granicę rozpuszczalności, bo rozpuszczalność większości organicznych ciał stałych spada wraz ze schładzaniem mieszaniny. Zamrażanie działa jeszcze ostrzej: czysty DMSO krzepnie w okolicach 18,5 °C, więc roztwór w czystym DMSO jest w lodówce stały, a tworzenie się lodu w mieszaninie z wodą zatęża wszystko, co pozostaje w kurczącej się fazie ciekłej – dlatego cykle zamrażania i rozmrażania trwale wytrącają związek z takich mieszanin. Chłodno, ciemno i bez zamrażania – tak literatura dotycząca postępowania z preparatami opisuje przechowywanie materiału po rekonstytucji. Zmętnienie mieszaniny w lodówce oznacza wytrącenie się substancji z roztworu, tak jak przy mieszaniu w złej kolejności.

Jakość DMSO, jałowość i rozumowanie autora

DMSO nie jest obojętnym rozcieńczalnikiem. Łatwo przenika przez skórę i błony, zabierając ze sobą rozpuszczone substancje, a w stężonej postaci działa drażniąco w kontakcie z tkankami – to jeden z powodów, dla których preparaty pozajelitowe zawierają niewielkie udziały współrozpuszczalników. Monografie dimetylosulfotlenku udało się znaleźć zarówno w USP-NF, jak i w Ph. Eur.; określają one limity czystości i zawartości wody, a DMSO jakości technicznej nie podlega wymaganiom tych monografii.

Autor nie znalazł jałowego DMSO poza środowiskiem farmaceutycznym i użył DMSO w jakości Ph. Eur. Filtr strzykawkowy z PTFE umożliwiłby filtrację wyjaławiającą, jak opisuje strona o filtrowaniu; PTFE to membrana przewidziana dla rozpuszczalników, podczas gdy niektóre membrany hydrofilowe stosowane do roztworów wodnych, na przykład z polietersulfonu, nie są przeznaczone do czystego DMSO. Autor nie miał takiego filtra pod ręką.

Według osobistej oceny autora w tym przypadku było to wystarczające, ponieważ sam DMSO ma właściwości antyseptyczne, a roztwór miesza się z wodą bakteriostatyczną, która zawiera konserwant. To własny pogląd autora, odnotowany jako taki.

Przeciwne stanowisko opiera się na samych standardach. Jakość Ph. Eur. potwierdza czystość, a nie jałowość. Działanie antyseptyczne zmniejsza niektóre populacje drobnoustrojów, ale nie jest zwalidowanym etapem wyjaławiania i nie usuwa przetrwalników ani endotoksyn. Alkohol benzylowy w wodzie bakteriostatycznej hamuje namnażanie i również nie wyjaławia. Według udokumentowanego standardu farmaceutycznego roztwór staje się jałowy dzięki filtrowi wyjaławiającemu 0,2–0,22 µm albo zwalidowanemu procesowi wyjaławiania, a nie dzięki właściwościom swoich składników. Ta strona odnotowuje oba stanowiska i nie rozstrzyga między nimi.

Obliczanie stężenia

Późniejsze obliczenia nie zależą od substancji. Stężenie to masa w fiolce podzielona przez całkowitą końcową objętość, łącznie ze współrozpuszczalnikiem, więc w tym przebiegu 5 mg rozkłada się na 3 ml mieszaniny, a nie na same 2,5 ml wody. Objętość zawierająca daną ilość to ta ilość podzielona przez stężenie. Kalkulator rekonstytucji wykonuje to przeliczenie jako przelicznik jednostek, a o jednostkach przeczytasz w artykule co naprawdę oznaczają mg, ml i j.m..

Status prawny

SLU-PP-332 nie jest dopuszczony do obrotu jako lek w Stanach Zjednoczonych, Unii Europejskiej, Australii ani nigdzie indziej i nie opublikowano żadnych danych klinicznych dotyczących bezpieczeństwa lub skuteczności u ludzi. To substancja badawcza, a etykieta „wyłącznie do celów badawczych” jest opisem handlowym, a nie kategorią regulacyjną. Status prawny różni się w zależności od kraju – ta kwestia ma własną stronę.

Częste pytania

Czy SLU-PP-332 to peptyd?

Nie. To syntetyczna mała cząsteczka opisywana jako pan-agonista receptorów związanych z estrogenem, a jej oznaczenie pochodzi z laboratoryjnej serii związków, a nie od sekwencji aminokwasów. Zachowuje się jak słabo rozpuszczalne w wodzie organiczne ciało stałe.

Czy SLU-PP-332 można rozpuścić w samej wodzie bakteriostatycznej?

Nie w stopniu, który miałby praktyczne znaczenie. Związek jest w dużej mierze niepolarny, więc woda nie oferuje mu korzystnych oddziaływań, a alkohol benzylowy w wodzie bakteriostatycznej to konserwant o stężeniu około 0,9%, zdecydowanie zbyt niskim, by działać jako współrozpuszczalnik. Dłuższe oczekiwanie czy użycie łaźni ultradźwiękowej daje jedynie zawiesinę, z której cząstki ponownie osiadają.

Dlaczego roztwór w DMSO dodaje się do wody, a nie odwrotnie?

Gdy niewielka objętość roztworu w DMSO trafia do większej, poruszanej objętości wody, pośredni skład występuje tylko w niewielkich obszarach cieczy, które w ciągu chwili ulegają rozcieńczeniu. Przy dodawaniu wody do roztworu w DMSO udział współrozpuszczalnika stopniowo maleje natomiast w całym roztworze, a wszędzie tam, gdzie rozpuszczona ilość przekracza to, co dana mieszanina jest w stanie utrzymać, związek się wytrąca.

Czy DMSO w jakości Ph. Eur. jest jałowy?

Nie. Jakość farmakopealna, taka jak Ph. Eur., określa limity czystości, substancji pokrewnych i zawartości wody; nie mówi nic o jałowości, chyba że produkt jest osobno wytwarzany i oznakowany jako jałowy. Udokumentowanym standardem wyjaławiania roztworu na bazie rozpuszczalnika jest filtracja przez membranę 0,22 µm odporną na dany rozpuszczalnik, na przykład z PTFE.

Co oznaczają smugi w fiolce?

Smugi, nazywane też szlirami (schlieren), to obszary o różnym współczynniku załamania światła, w których roztwór w DMSO i woda jeszcze się nie wymieszały. To zjawisko związane z mieszaniem, a nie oznaka wytrącania, i znikają, gdy ciecz po zakręceniu fiolką uzyska jednolity skład. Utrzymujące się zmętnienie lub widoczne cząstki to coś innego i wskazują na ciało stałe, które wypadło z roztworu.

Dlaczego z DMSO obchodzono się szybko?

DMSO jest silnym rozpuszczalnikiem wielu tworzyw sztucznych i może rozpuścić warstwę poślizgową na wewnętrznej ściance plastikowego cylindra strzykawki. Im krótszy kontakt czystego DMSO ze strzykawką, tym mniej materiału przechodzi do cieczy – dlatego autor wykonywał każde przeniesienie sprawnie, ale bez pośpiechu.

Czy łaźnia ultradźwiękowa coś zmienia?

Sonikacja zmienia to, jak szybko zachodzi rozpuszczanie, a nie to, czy w ogóle może zajść. Rozbija aglomeraty i odświeża warstwę cieczy wokół każdej cząstki, ale rozpuszczalność równowagowa pozostaje bez zmian.

Czy SLU-PP-332 jest lekiem dopuszczonym do obrotu?

Nie. Nie ma pozwolenia na dopuszczenie do obrotu w żadnym z głównych systemów regulacyjnych ani opublikowanych danych klinicznych dotyczących bezpieczeństwa lub skuteczności u ludzi. Etykieta „wyłącznie do celów badawczych” nie daje żadnej gwarancji tożsamości, czystości ani jałowości wynikającej z nadzoru regulacyjnego.

Źródła

1. Billon C, Sitaula S, Banerjee S, et al. Synthetic ERRα/β/γ agonist induces an ERRα-dependent acute aerobic exercise response and enhances exercise capacity. ACS Chemical Biology 2023;18(4):756–771. doi:10.1021/acschembio.2c00720. Preclinical mouse data; no human data. PubMed 36988910
2. Yalkowsky SH. Solubility and Solubilization in Aqueous Media. American Chemical Society / Oxford University Press, 1999. Log-linear cosolvency model.
3. Strickley RG. Solubilizing excipients in oral and injectable formulations. Pharmaceutical Research 2004;21(2):201–230. PubMed 15032302
4. USP-NF monograph "Dimethyl Sulfoxide"; European Pharmacopoeia monograph "Dimethyl sulfoxide" (Dimethylis sulfoxidum). Purity and water-content limits for pharmacopoeial grades.
5. USP General Chapter 797, Pharmaceutical Compounding — Sterile Preparations. Aseptic technique and closure disinfection. usp.org
6. U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing — Current Good Manufacturing Practice. September 2004. Sterilising filters with a rated pore size of 0.2 µm or smaller; 0.22 and 0.2 µm treated as interchangeable nominal ratings. fda.gov

Ogólne, neutralne informacje o chemii substancji badawczej i opis jednego udokumentowanego przebiegu – nie porada medyczna, nie zalecenie dawkowania ani stosowania i nie zachęta do zdobywania jakiejkolwiek substancji. SLU-PP-332 nie ma pozwolenia na dopuszczenie do obrotu, a to, czy posiadanie i stosowanie są legalne, zależy od prawa kraju zamieszkania. Pytania o zdrowie należy kierować do wykwalifikowanego lekarza lub farmaceuty.