Filtry strzykawkowe do roztworów peptydów po rekonstytucji

Pod jednym słowem „filtrowanie” kryją się dwie różne rzeczy: sprzęt oraz twierdzenie o bezpieczeństwie, którego ten sprzęt nie potwierdza. Strona sprzętowa jest dobrze opisana – dokumentacja filtrów do wodnych roztworów białek wymienia sterylizującą membranę 0,22 µm, hydrofilowy materiał taki jak PES, obudowę o małej średnicy i złącze Luer-lock, wszystko dostarczane jako jałowe i jednorazowe. Ta specyfikacja opisuje sprzęt, który zatrzymuje bakterie i cząstki stałe, i nic poza tym; to, czy etap filtracji jest w ogóle wskazany, to osobne pytanie – do farmaceuty lub lekarza.

Co oznacza filtracja sterylizująca

Filtr strzykawkowy to niewielka obudowa z tworzywa sztucznego ze szczelnie zamocowaną wewnątrz membraną. Przepychany płyn przechodzi przez membranę; wszystko, co jest większe od deklarowanej wielkości porów, zostaje po stronie napływowej.

„Sterylizujący” to zdefiniowana klasyfikacja techniczna, a nie przymiotnik marketingowy. Według ASTM F838 membrana zyskuje to miano, jeśli zatrzymuje określoną dawkę bakterii testowych na centymetr kwadratowy powierzchni filtra: Brevundimonas diminuta, która przy rozmiarze około 0,3 µm jest jedną z najmniejszych bakterii dających się hodować. To właśnie ten test sprawił, że 0,22 µm stało się międzynarodową konwencją sterylizacji roztworów wodnych: przy tej wielkości porów zatrzymywane są bakterie, drożdże i pleśnie.

Na opakowaniach filtrów tej samej klasy pojawia się zarówno 0,2 µm, jak i 0,22 µm – to różnica w oznaczeniach stosowanych przez producentów od dziesięcioleci, a nie różnica w zdolności zatrzymywania.

Wielkości porów i to, co każda z nich zatrzymuje

Najwięcej nieporozumień dotyczy oznaczenia 0,45 µm. Dokumentacja opisuje takie filtry jako przeznaczone do klarowania lub filtracji wstępnej. Właśnie dlatego, że przepuszczają małe bakterie, standardem filtracji sterylizującej stały się pory 0,22 µm. Jeszcze mniejsze pory służą innym celom – membrana sterylizująca zatrzymuje bakterie, ale nie wszystko.

Materiał membrany a adsorpcja peptydu

Materiał ma takie samo znaczenie jak wielkość porów, z powodu niezwiązanego z przesiewaniem: peptydy adsorbują się na powierzchni niektórych membran i w ten sposób ubywa ich z roztworu.

O tym, czy roztwór wodny w ogóle przejdzie, decyduje to, czy membrana jest hydrofilowa, czy hydrofobowa. Peptyd po rekonstytucji jest rozpuszczony w wodzie, więc membrana musi być hydrofilowa; membrana hydrofobowa nie zwilży się wodą, jeśli wcześniej nie zostanie zwilżona alkoholem – a to wprowadza pozostałości rozpuszczalnika na etapie, który ma służyć usuwaniu zanieczyszczeń.

W nazwach materiałów powtarza się jedna pomyłka: azotan celulozy silnie wiąże białka, podczas gdy octan celulozy i celuloza regenerowana wiążą je słabo. Samo słowo „celuloza” nic nie mówi o zdolności wiązania.

Średnica obudowy, objętość martwa i złącze

Objętość martwa filtra (hold-up volume) – płyn zatrzymany w obudowie i membranie, gdy tłok dojdzie do końca – rośnie wraz ze średnicą obudowy. Karty katalogowe producentów przypisują mniejszym obudowom mniejsze objętości próbek: obudowa 4 mm jest podawana dla objętości około 1 ml, obudowa 13 mm – dla mniej więcej 1–10 ml. Objętość martwa urządzenia 13 mm jest rzędu kilkudziesięciu mikrolitrów; urządzenie 25 mm zatrzymuje znacznie więcej, w niektórych konstrukcjach ponad 1 ml – to duża część zawartości pojemnika, który mieści łącznie 1–2 ml.

Dwie kolejne cechy specyfikacji wynikają z konstrukcji, a nie z preferencji. Luer-lock to złącze gwintowane; Luer-slip jest złączem wciskanym, a nacisk na tłok może rozłączyć takie połączenie w trakcie przepychania. Filtry sterylizujące są dostarczane w pojedynczych, zamkniętych opakowaniach i sterylizowane końcowo promieniowaniem gamma lub tlenkiem etylenu – uzyskanie jałowego filtratu wymaga użycia jałowego filtra. Ta sama specyfikacja przewiduje jednorazowe użycie: zużyta membrana jest mokra, obciążona zatrzymanym materiałem i już niejałowa.

Czego filtracja nie usuwa

Tu możliwości filtra membranowego są regularnie przeceniane. Membrana 0,22 µm to bariera oddzielająca cząstki według wielkości, zatrzymująca bakterie i cząstki stałe – i to cała jej funkcja.

• Endotoksyny (pirogeny) przechodzą. To fragmenty lipopolisacharydów ze ścian komórkowych bakterii, znacznie mniejsze niż por i odporne na ciepło; przechodzą tak samo przez membrany 0,22 µm, jak i 0,1 µm. Martwe bakterie zatrzymane na membranie same są źródłem endotoksyn.
• Wirusy przechodzą. Cząstki wirusowe są mniej więcej o rząd wielkości mniejsze od bakterii; do ich zatrzymania potrzebny jest nanofiltr 20 nm.
• Zanieczyszczenia rozpuszczone przechodzą. Metale ciężkie, pozostałości rozpuszczalników i produkty rozpadu przemieszczają się razem z rozpuszczalnikiem. Tożsamość substancji i jej czystość sprawdza się metodami HPLC i spektrometrii mas, a nie za pomocą filtra.
• Jałowość, brak pirogenów i czystość to trzy różne właściwości. Klarowny, przefiltrowany roztwór może spełniać pierwszą i nie spełniać dwóch pozostałych, a jego wygląd nie pozwala tego rozstrzygnąć.

Najbardziej przydatna wiedza o filtrze membranowym dotyczy więc tego, czego nie jest w stanie zrekompensować: przepuszczenie roztworu przez filtr nie zmienia niczego w jego pochodzeniu, tożsamości substancji, czystości ani wcześniejszym sposobie postępowania z nim.

Czy filtracja może pogorszyć sytuację?

Może. Każda dodatkowa manipulacja w zamkniętym układzie to kolejna okazja do skażenia, a nie ma opublikowanych dowodów, że filtracja poza warunkami apteki ostatecznie zmniejsza ryzyko; o wyniku decyduje bardziej zachowanie zasad aseptyki podczas całej czynności niż sama membrana. Filtry nie są też całkowicie obojętne – substancje ekstrahowalne i wymywalne (extractables i leachables) to uznany temat w literaturze farmaceutycznej, choć drugorzędny wobec kwestii obchodzenia się z preparatem.

Gdzie ubywa peptydu

Strata nie wynika z przesiewania: cząsteczka peptydu ma kilka nanometrów średnicy wobec poru 220 nm i przechodzi swobodnie. To, co znika, wyjaśniają dwa mechanizmy. Adsorpcja na membranie wiąże peptyd z powierzchnią membrany, aż dostępne miejsca się nasycą – dlatego pierwsza przefiltrowana porcja traci proporcjonalnie najwięcej; przy membranach o niskim wiązaniu, takich jak PES, straty opisywane w literaturze metodycznej są niewielkie. Objętość martwa to opisana wyżej zatrzymana objętość, która zostaje w urządzeniu.

Oba efekty opisuje laboratoryjna literatura metodyczna, która wymienia wstępne zwilżanie membrany i wypieranie objętości martwej wśród standardowych czynności przygotowania próbek w laboratorium analitycznym – są to procedury przeznaczone do wykonywania w takim laboratorium i przy użyciu jego wyposażenia, dlatego nie opisujemy ich tutaj. Oba mechanizmy wyjaśniają raczej charakter straty niż sposób jej uniknięcia: objętość martwa jest stała, a liczba miejsc adsorpcji jest ograniczona, więc oba mechanizmy powodują utratę tym większej części materiału wyjściowego, im mniejsza objętość i im niższe stężenie.

Zmętnienie wcześniej klarownego roztworu

Zmętnienie, które pojawia się godziny lub dni po rekonstytucji w roztworze, który był klarowny, praktyka farmaceutyczna opisuje jako oznakę wzrostu drobnoustrojów albo wytrącania się peptydu z roztworu. Żadne z nich nie jest problemem do rozwiązania filtracją, a standardowe postępowanie z preparatem, którego jakość budzi wątpliwości, to wyrzucenie go, a nie klarowanie: przepuszczenie mętnego roztworu przez membranę usuwa widoczny ślad, ale endotoksyny i produkty rozpadu zostają w filtracie. W literaturze dotyczącej filtracji deklarowanym celem etapu klarowania jest usuwanie cząstek stałych o znanym, niemikrobiologicznym pochodzeniu, takie jak nierozpuszczona substancja tuż po zmieszaniu. Zmętnienie, które pojawia się dopiero po połączeniu kilku peptydów w jednej strzykawce, ma inne, chemiczne wyjaśnienie, omówione w artykule mieszanie peptydów w jednej strzykawce.

Jak normy opisują tę operację

Filtracja sterylizująca to proces farmaceutyczny opisany w opublikowanych normach i wytycznych: rozdziale ogólnym USP <797>, odpowiednich rozdziałach farmakopei w Europie i wytycznych FDA dotyczących wytwarzania aseptycznego. Teksty te opisują ją jako wykonywaną w środowisku o kontrolowanej jakości powietrza przez personel z udokumentowanym przeszkoleniem w technice aseptycznej – i dlatego traktują filtrację sterylizującą jako czynność apteczną lub produkcyjną.

Te rozdziały regulują raczej ramy niż ruchy rąk, a zwalidowana integralność filtra jest częścią tych ram: od filtra sterylizującego używanego w produkcji oczekuje się weryfikacji testem fizycznym – testem punktu pęcherzykowego (bubble point) albo przepływu dyfuzyjnego – co z kolei wymaga własnego sprzętu, kryteriów akceptacji i dokumentacji. Nic z tego wyposażenia nie istnieje poza środowiskiem, dla którego zostało opisane.

Co do samej techniki, te same normy odnotowują ustalenia, a nie sekwencję czynności. Dezynfekcja zamknięcia, powierzchnie kontaktowe i jakość powietrza decydują o wyniku co najmniej w takim samym stopniu jak membrana, a nadmierna różnica ciśnień na membranie jest udokumentowaną przyczyną awarii filtra. Wszystkie te teksty zgodnie określają, kto i gdzie powinien wykonywać tę czynność: przeszkolony personel w kontrolowanym środowisku, a specyfikacja filtra jest tylko jedną jej częścią.

Podsumowanie specyfikacji

To wartości, które powtarzają się w dokumentacji filtrów do wodnych roztworów białek i peptydów. Opisują element sprzętu i jego deklarowane parametry – a nie wskazanie do jego użycia, które jest pytaniem do farmaceuty lub lekarza, a nie do tabeli specyfikacji.

Najczęstsze pytania

Jaka wielkość porów jest uznawana za sterylizującą?

Za sterylizującą dla roztworów wodnych uznaje się membranę 0,22 µm, walidowaną badaniem retencji bakterii według ASTM F838. Membrana 0,45 µm klaruje płyn, ale nie jest przeznaczona do zatrzymywania organizmu testowego i literatura opisuje ją jako filtr wstępny.

Czy 0,2 µm to coś innego niż 0,22 µm?

Nie. Obie liczby to historyczne konwencje oznaczania stosowane przez różnych producentów dla tej samej klasy sterylizującej. Skuteczność zatrzymywania określa ten sam test, a nie nadrukowana liczba.

Które materiały membran najsłabiej wiążą peptydy?

Polieterosulfon (PES), PVDF poddany hydrofilizacji, octan celulozy i celuloza regenerowana należą do materiałów o niskim wiązaniu białek. Nylon silnie wiąże peptydy, a PTFE jest hydrofobowy, więc żadnego z nich nie przewiduje się do wodnych roztworów peptydów.

Czy filtracja sterylizująca usuwa endotoksyny?

Nie. Endotoksyny to fragmenty ścian komórkowych bakterii, znacznie mniejsze niż por 0,22 µm, i przechodzą przez niego. Jałowość, brak pirogenów i czystość chemiczna to trzy odrębne właściwości, a filtr membranowy odpowiada tylko za pierwszą.

Ile płynu zostaje w filtrze strzykawkowym?

Objętość martwa filtra (hold-up volume) rośnie wraz ze średnicą obudowy. Obudowa 13 mm zatrzymuje zwykle kilkadziesiąt mikrolitrów, a obudowa 25 mm może zatrzymać znacznie więcej – to spora część zawartości pojemnika, w którym jest tylko mililitr czy dwa.

Czy filtra strzykawkowego można użyć więcej niż raz?

Nie. Filtry sterylizujące są dostarczane w pojedynczych, zamkniętych opakowaniach do jednorazowego użytku. Zużyta membrana jest mokra, obciążona zatrzymanym materiałem i już niejałowa, a zamiast bariery stanowi powierzchnię, na której mogą rosnąć drobnoustroje.

Źródła

• ASTM F838, Standard Test Method for Determining Bacterial Retention of Membrane Filters Utilized for Liquid Filtration.
• United States Pharmacopeia, rozdział ogólny <797>, Pharmaceutical Compounding – Sterile Preparations.
• Farmakopea Europejska 5.1.1, Methods of preparation of sterile products.
• U.S. Food and Drug Administration, Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing – Current Good Manufacturing Practice (2004).
• PDA Technical Report No. 26, Sterilizing Filtration of Liquids.
• Karty katalogowe producentów sterylizujących filtrów strzykawkowych – w zakresie średnicy obudowy, objętości martwej i podawanych zakresów objętości próbek.

Co jest najważniejsze

Ta strona ma charakter ogólnoinformacyjny – nie jest poradą medyczną, zaleceniem stosowania ani instrukcją wykonania czegokolwiek. Membrana sterylizująca to bariera zatrzymująca bakterie i cząstki stałe ze względu na ich wielkość. Właściwości, które ludzie chcieliby dzięki niej zagwarantować – brak pirogenów, tożsamość substancji, czystość, wiarygodność źródła – nie zależą jednak od zastosowania filtra. Powiązane strony informacyjne: rekonstytucja, woda bakteriostatyczna i jałowa, podstawy bezpiecznego wstrzykiwania i przelicznik jednostek.