Mélanger des peptides dans une seringue

Ce texte relève de l'information générale : ni avis médical, ni recommandation d'utilisation. Il décrit ce qui se passe, chimiquement, quand deux solutions de peptides se retrouvent dans le même corps de seringue. Beaucoup des substances évoquées ici n'ont aucune autorisation de mise sur le marché, ou ne s'obtiennent que sur prescription médicale.

Quiconque a manipulé plusieurs solutions de peptides connaît ce moment. On prélève la première, puis la deuxième, puis la troisième, toutes limpides comme de l'eau. Arrive la quatrième et, en quelques secondes, des filaments blancs flottent dans le corps de la seringue.

C'est ce que l'usage appelle un « crash » : le composé est sorti de la solution, il a précipité. Ce n'est pas un défaut d'aspect, c'est la fin de cette préparation.

À quoi ressemble un « crash »

Les photographies ci-dessous viennent d'un cas de ce genre. Trois solutions de peptides avaient été prélevées l'une après l'autre, et le corps de la seringue restait limpide ; l'une des préparations était livrée avec un solvant de chlorure de sodium à 0,9 %. Le quatrième prélèvement portait sur un peptide lipidé de la classe des GLP-1, et le mélange a viré aussitôt :

De près, il ne s'agit pas de bulles mais de flocons solides, qui s'accumulent contre le piston :

Le déclencheur n'a très probablement pas été le dernier composé ajouté, mais ce qui se trouvait déjà dans le corps de la seringue.

Ce qui se passe réellement lors d'un « crash »

Un peptide reste en solution parce que ses molécules portent la même charge électrique et se repoussent donc mutuellement. Que cette charge disparaisse, et elles s'assemblent, deviennent trop grosses pour rester dissoutes, puis quittent la solution.

Le pH auquel les charges positives et négatives d'un peptide se compensent exactement porte un nom : le point isoélectrique (pI). La charge nette y est nulle, la répulsion s'évanouit, et c'est là que tout peptide atteint sa solubilité minimale. Plus le pH de la solution approche du pI, plus la précipitation devient probable.

Deux chemins qui mènent un mélange vers le point isoélectrique

Le pH se déplace. Les peptides de recherche arrivent pratiquement toujours sous forme de poudre lyophilisée, sans tampon. C'est ce qui les sépare d'une spécialité pharmaceutique finie, dont la formulation comporte un système tampon qui verrouille le pH. Reconstituée hors de ce cadre, une solution est pratiquement non tamponnée : le moindre ajout en déplace le pH aussitôt, sans rencontrer de résistance. S'y ajoute la question du contre-ion. Les peptides de synthèse sont fournis par défaut sous forme de sel de TFA (acide trifluoroacétique, résidu de la purification), plus rarement d'acétate. Ces deux contre-ions sont acides, si bien que plusieurs solutions de ce type réunies dans un même corps de seringue glissent vers l'acidité, la zone même où les peptides de type GLP-1 ont leur pI.

La force ionique augmente. Le second mécanisme est le relargage (salting out). Les ions du sel retiennent autour d'eux des molécules d'eau qui ne sont dès lors plus disponibles pour la couche d'hydratation du peptide. Passé une certaine concentration, il n'en reste plus assez et le peptide quitte la solution, indépendamment du pH. Le phénomène est bien documenté pour les peptides lipidés.

Pourquoi les peptides lipidés sont le maillon fragile

Le rétatrutide, composé expérimental qui n'est autorisé comme médicament dans aucun pays, est un peptide lipidé : une chaîne d'acide gras l'arrime à l'albumine et explique sa longue demi-vie. Cette même chaîne rend ses molécules promptes à s'associer entre elles, et son pI se situe en zone faiblement acide, entre 4,5 et 5,5 environ, c'est-à-dire à peu près là où glisse un mélange de solutions peptidiques acides. Aucune donnée de compatibilité publiée n'existe le concernant ; ce qui est documenté pour les peptides lipidés en général, c'est qu'une force ionique croissante abaisse leur solubilité, ce qui concorde avec le schéma rapporté : la précipitation est décrite là où du chlorure de sodium est présent dans le corps de la seringue, et non là où il en est absent. Un comportement comparable n'est que rarement décrit pour les autres actifs lipidés de la classe des GLP-1, soumis à prescription : particularité d'une molécule, donc, plutôt qu'effet de classe.

D'où l'intérêt du cas décrit plus haut : le solvant est la source de sel la plus probable. Les préparations livrées avec une ampoule de chlorure de sodium à 0,9 %, dont la formulation apporte en outre des sels tampons et du mannitol, augmentent la force ionique de tout ce qu'elles rencontrent. Ces préparations sont en général des médicaments soumis à prescription, et pour un médicament autorisé, c'est le résumé des caractéristiques du produit qui fait foi. Force ionique élevée d'un côté, pH glissé vers le point isoélectrique de l'autre : cette combinaison suffit à faire quitter la solution à la molécule la moins robuste. Le composé qui a visiblement précipité était probablement en parfait état ; il était simplement le plus fragile dans un environnement créé par les autres.

Pourquoi le « tout dans une seule seringue » est d'emblée une question épineuse

La pharmacie hospitalière tient de vastes tableaux de compatibilité indiquant si deux solutions injectables peuvent partager une seringue. Ils existent parce que la réponse ne se déduit pas : chaque association est éprouvée au laboratoire, sur la turbidité, les particules, le déplacement du pH et la perte d'activité.

Pour les peptides de recherche, ces tableaux n'existent pas. Aucune donnée publiée ne décrit ce que l'un de ces composés fait à un autre, dans quel ordre, à quelle concentration, dans quel solvant. Un mélange dans un corps de seringue est une expérience menée sur un échantillon unique.

Et ce qui se voit n'est qu'une partie du tableau. Une précipitation avec flocons saute aux yeux ; un déplacement de pH qui dégrade lentement un peptide, ou le pousse vers des agrégats solubles, passe inaperçu. Une seringue mélangée et limpide ne prouve donc rien : elle signale seulement l'absence de preuve du contraire.

La deuxième classe d'erreurs : des concentrations qui ne s'additionnent plus

La chimie ne représente que la moitié du prix d'un corps de seringue partagé ; l'autre moitié relève de la comptabilité. Une graduation en unités sur une seringue à insuline mesure un volume, et un volume ne correspond à une quantité de composé que si l'on connaît la concentration derrière. Deux solutions de titres différents dans un même corps donnent un mélange dont la composition ne se lit plus sur les graduations, et une précipitation partielle en retire encore une part inconnue. Cette confusion des concentrations forme une classe d'erreurs à part entière, indépendante du pH, et c'est pourquoi le calcul ne vaut que flacon par flacon.

Ce que vaut une préparation dans cet état

Rien. Seringue et aiguille relèvent du collecteur pour objets piquants et coupants, et non d'un retour dans un flacon. Les raisons en sont solides :

• La quantité n'est plus celle qui a été calculée. Ce qui a floculé n'est plus dissous, et la part de composé restée en solution est inconnue : tout chiffre établi auparavant est caduc.
• Les particules n'ont rien à faire dans les tissus. Les précipités issus d'incompatibilités sont une source reconnue de contamination particulaire, bien décrite dans le domaine de la sécurité des médicaments ; par voie sous-cutanée, les conséquences sont le plus souvent locales, de l'irritation au granulome, ce nodule palpable de réaction à corps étranger.
• L'aiguille peut se boucher. Des flocons solides et le canal très fin d'une aiguille à insuline font mauvais ménage, et une obstruction partielle ne se voit pas toujours de l'extérieur.
• Remettre en solution n'efface rien. La chaleur ou une rotation douce peuvent redonner à la matière une apparence dissoute, mais l'aspect ne dit rien de l'intégrité de la molécule ni de son état d'agrégation. Or c'est justement par l'agrégation que des peptides peuvent devenir immunogènes.

Trois voies sont parfois empruntées, et toutes aggravent le problème : vider le corps de la seringue dans un flacon transporte le précipité dans le flacon de réserve, rincer laisse l'inconnue exactement où elle était, et un filtre retire les particules en même temps que le composé.

Les flacons eux-mêmes sont concernés de la même façon : celui qui est trouble, floconneux ou filandreux n'est plus utilisable lui non plus, tout comme un flacon limpide dont le dépôt ne se redissout pas quand on fait tourner le flacon.

La convention qui rend la question sans objet

Un peptide par seringue. C'est toute la règle. Chacun des points qui la sous-tendent est un mécanisme, non une préférence :

• Le solvant décide. Le sérum physiologique est décrit comme le déclencheur des précipitations avec les peptides lipidés de type GLP-1, et tout ce qui y est reconstitué propage cette force ionique. Ce qui distingue les deux solvants est traité dans eau bactériostatique vs eau stérile.
• Le maillon le plus faible fixe la limite. La molécule dont la marge de solubilité est la plus étroite décide de la tenue de l'ensemble.
• La turbidité est une observation minutée. Dans les essais de compatibilité, une association se juge après un temps de repos défini, car un voile peut mettre plusieurs minutes à se former ; un mélange limpide dans les premières secondes n'a pas été jugé du tout.
• Cisaillement et mousse favorisent l'agrégation, raison pour laquelle le geste décrit pour la reconstitution est un roulement doux et non une agitation. La formulation qu'en donne la littérature pharmaceutique est reprise dans reconstituer des peptides.
• Le contrôle visuel a une norme. L'examen d'une solution devant un fond clair, à la recherche de particules visibles, est le contrôle prévu par les pharmacopées, décrit à l'USP <790> et à la Pharmacopée européenne 2.9.20. Son verdict est binaire : limpide veut dire limpide, pas presque limpide.

Comment se reconnaît un précipité

Le plus simple pour distinguer l'air d'un précipité, c'est le temps : les bulles montent et disparaissent, les flocons restent et dérivent.

La partie tranquille : le calcul

La partie neutre de l'affaire, c'est le chiffre porté sur la seringue. À partir de la quantité de composé contenue dans un flacon et du volume d'eau bactériostatique ajouté, notre calculateur le traduit en unités : de l'arithmétique, pas une incitation à utiliser quoi que ce soit. Noter la date de reconstitution d'un flacon et surveiller combien de temps il reste dans les conditions de conservation décrites, voilà à quoi sert le suivi de peptides.

Questions fréquentes

Que signifie une seringue de peptides mélangés devenue trouble ?

Un trouble, des filaments ou des flocons blancs signifient que du peptide est sorti de la solution : c'est un précipité. Il s'agit d'une modification physique de la préparation, pas d'un simple défaut d'aspect.

Pourquoi des solutions de peptides précipitent-elles lorsqu'on les réunit ?

Les peptides restent dissous parce que leurs molécules portent la même charge nette et se repoussent mutuellement. Réunir des solutions non tamponnées peut déplacer le pH vers le point isoélectrique de l'un d'eux, où cette charge s'annule, ou faire monter la concentration en sel jusqu'à ce qu'il reste trop peu d'eau libre.

Qu'est-ce que le point isoélectrique d'un peptide ?

Le point isoélectrique, abrégé pI, est le pH auquel les charges positives et négatives d'un peptide se compensent et où la charge nette devient nulle. La solubilité y est minimale : plus le pH d'une solution est proche du pI, plus le peptide est susceptible de précipiter.

Existe-t-il des tableaux de compatibilité pour associer des solutions de peptides ?

La pharmacie hospitalière utilise des tableaux de compatibilité pour les solutions injectables autorisées, établis au laboratoire par des essais de turbidité, de particules, de déplacement du pH et de perte d'activité. Il n'existe rien de comparable pour les peptides de recherche : le comportement d'une association ne se déduit donc pas.

Un précipité peut-il être redissous ou retiré par filtration ?

La chaleur ou un roulement doux peuvent le faire disparaître à l'œil, mais l'aspect ne dit rien de l'intégrité de la molécule ni de la formation d'agrégats. La filtration retire les particules et, avec elles, une part inconnue du composé : ni l'une ni l'autre ne ramène la préparation à un état connu.

Une seringue mélangée limpide signifie-t-elle que l'association était compatible ?

Non. La précipitation visible n'est que le mode de défaillance évident ; un déplacement de pH qui dégrade lentement un peptide ou le pousse vers des agrégats solubles laisse le liquide parfaitement limpide. L'absence de turbidité ne prouve pas la compatibilité.

D'où viennent ces conventions

• Chapitres généraux USP <790> et <1790> sur les particules visibles et le contrôle visuel (https://www.usp.org).
• Pharmacopée européenne 2.9.20, Contamination particulaire : particules visibles, EDQM (https://www.edqm.eu).
• Trissel's Handbook on Injectable Drugs (ASHP), l'ouvrage de référence en matière de compatibilité.
• Revues sur la stabilité des solutions de peptides et de protéines (pH, force ionique, agrégation), par exemple Manning et al., Pharmaceutical Research, 2010.

En résumé

Un « crash » ne trahit pas un défaut de matière, c'est de la chimie. Dès que le pH d'une solution non tamponnée glisse vers le point isoélectrique, ou que la force ionique monte, la molécule la plus fragile perd sa solubilité et quitte la solution.

Une seringue où flottent des filaments ou des voiles est une perte sèche : on ne la filtre pas, on ne la redissout pas. Et la convention qui écarte le problème n'a rien de sophistiqué : un peptide par seringue.